Novice

MINI PREGLED

Predstraža proti raku: univerzalni označevalci raka

Chengchen Qian1, Xiaolong Zou2, Wei Li1,3, Yinshan Li4, Wenqiang Yu5

1Shanghai Epiprobe Biotechnology Co., Ltd, Šanghaj 200233, Kitajska;2 Oddelek za splošno kirurgijo, Prva pridružena bolnišnica Harbinske medicinske univerze, Harbin 150001, Kitajska;3Shandong Epiprobe Medical Laboratory Co., Ltd, Heze 274108, Kitajska;4 Ljudska bolnišnica avtonomne regije Ningxia Hui, medicinska univerza Ningxia, Yinchuan 750002, Kitajska;5 Klinični center za javno zdravje Šanghaj & Oddelek za splošno kirurgijo, Bolnišnica Huashan & Inštitut za metastaze raka & Laboratorij za epigenetiko RNK, Inštituti za biomedicinske znanosti, Šanghajski medicinski kolidž, Univerza Fudan, Šanghaj 200032, Kitajska

POVZETEK

Rak je vodilni vzrok smrti po vsem svetu.Zgodnje odkrivanje raka lahko zmanjša umrljivost za vse vrste raka;vendar za večino vrst raka manjkajo učinkoviti biomarkerji za zgodnje odkrivanje.Metilacija DNA je bila vedno glavna tarča zanimanja, ker se metilacija DNA običajno pojavi pred drugimi zaznavnimi genetskimi spremembami.Med raziskovanjem skupnih značilnosti raka z uporabo novega vodnika za določitev zaporedja pozicioniranja za metilacijo DNK se je vrsta univerzalnih markerjev raka (UCOM) pojavila kot močni kandidati za učinkovito in natančno zgodnje odkrivanje raka.Medtem ko je klinična vrednost trenutnih biomarkerjev raka zmanjšana zaradi nizke občutljivosti in/ali nizke specifičnosti, edinstvene značilnosti UCOM zagotavljajo klinično pomembne rezultate.Validacija kliničnega potenciala UCOM pri raku pljuč, materničnega vratu, endometrija in urotelija dodatno podpira uporabo UCOM pri več vrstah raka in različnih kliničnih scenarijih.Pravzaprav se aplikacije UCOM trenutno aktivno preiskujejo z nadaljnjim vrednotenjem zgodnjega odkrivanja raka, pomožne diagnoze, učinkovitosti zdravljenja in spremljanja ponovitve.Molekularni mehanizmi, s katerimi UCOM odkrivajo raka, so naslednje pomembne teme, ki jih je treba raziskati.Uporaba UCOM v realnih scenarijih prav tako zahteva implementacijo in izboljšavo.

KLJUČNE BESEDE

Odkrivanje raka;presejanje raka;metilacija DNA;epigenetika raka;biomarkerji raka

Zakaj nujno potrebujemo novo biomarkerji?

Po več kot stoletnem boju proti raku je rak še vedno najbolj smrtonosna biološka grožnja človeštvu.Rak ostaja globalna zdravstvena skrb z 19,3 milijona novih primerov in skoraj 10 milijoni smrti, ocenjenih v letu 20201. Leta 2020 je bilo na Kitajskem diagnosticiranih 4,6 milijona novih primerov raka, kar predstavlja 23,7 % novih primerov raka na svetu po podatkih GLOBOCAN1.Poleg tega je bilo leta 2020 na Kitajskem približno 3 milijone smrti pripisanih raku, kar je bilo 30 % svetovnih smrti, povezanih z rakom1.Ti statistični podatki kažejo, da je Kitajska na prvem mestu glede pojavnosti in umrljivosti zaradi raka.Poleg tega je 5-letna stopnja preživetja raka 40,5 %, kar je 1,5-krat manj kot 5-letna stopnja preživetja v ZDA2,3.Sorazmerno nižje preživetje in višje stopnje umrljivosti na Kitajskem kot v državah z višjimi indeksi človekovega razvoja kažejo, da je nujno potreben učinkovit in stroškovno učinkovit sistem za preprečevanje in nadzor raka.Zgodnje odkrivanje raka je eden najbolj kritičnih elementov v zdravstvenem sistemu.Zgodnje odkrivanje raka lahko izboljša prognozo in preživetje v zgodnji fazi pri skoraj vseh vrstah raka4.Uspešne presejalne strategije so privedle do znatnega zmanjšanja incidence in umrljivosti zaradi raka materničnega vratu, dojke, debelega črevesa in danke ter raka prostate.

Zgodnje odkrivanje raka pa ni lahka naloga.Raziskovanje biologije in prognoze zgodnjega raka, prepoznavanje in potrjevanje zanesljivih biomarkerjev za zgodnje odkrivanje ter razvoj dostopnih in natančnih tehnologij za zgodnje odkrivanje so bile vedno največje ovire v procesu4.Z natančnim odkrivanjem raka lahko ločimo benigne od malignih lezij, s čimer se izognemo nepotrebnim posegom in olajšamo nadaljnje obvladovanje bolezni.Trenutne strategije zgodnjega odkrivanja vključujejo endoskopske biopsije, medicinsko slikanje, citologijo, imunske teste in teste biomarkerjev5-7.Ker so biopsije, ki temeljijo na endoskopu, vsiljive in drage, imajo same po sebi veliko breme kot pomemben medicinski postopek, ki se opira na strokovno osebje.Tako kot citologija sta obe presejalni metodi odvisni od zdravstvenih delavcev in temeljita na osebni presoji z učinkovitostjo, ki je daleč od idealne8.Nasprotno pa so imunski testi zelo netočni glede na visoke stopnje lažno pozitivnih rezultatov.Medicinsko slikanje kot presejalna taktika zahteva drago opremo in specializirane tehnike.Zato je medicinsko slikanje zaradi nizke dostopnosti izjemno omejeno.Zaradi vseh teh razlogov se zdi, da so biomarkerji boljša možnost za zgodnje odkrivanje raka.

Korespondenca: Yinshan Li in Wenqiang Yu

Email: liyinshan@nxrmyy.com and wenqiangyu@fudan.edu.cn

ORCID ID: https://orcid.org/0009-0005-3340-6802 in

https://orcid.org/0000-0001-9920-1133

Prejeto 22. avgusta 2023;sprejeto 12. oktobra 2023;

objavljeno na spletu 28. novembra 2023.

Na voljo na www.cancerbiomed.org

Mednarodna licenca Attribution-NonCommercial 4.0

Biomarkerji so trenutno kategorizirani kot proteini, označevalci mutacij DNA, epigenetski označevalci, kromosomske nepravilnosti, označevalci RNA, pridobljeni neposredno iz tumorjev, ali tumorski fragmenti, pridobljeni posredno iz telesnih tekočin.Proteinski markerji so najpogosteje uporabljeni biomarkerji pri presejanju in diagnosticiranju raka.Proteinski biomarkerji kot presejalni biomarkerji so omejeni zaradi nagnjenosti, da jih prizadenejo benigne lezije, kar vodi do prekomerne diagnoze in prekomernega zdravljenja, kot so poročali za α-fetoprotein in za prostato specifični antigen (PSA)9,10.Označevalci RNA vključujejo vzorce genetske ekspresije in druge nekodirajoče označevalce RNA. Kombinacijo označevalcev genetske ekspresije RNA je mogoče odkriti z uporabo vzorcev urina, katerih občutljivost še zdaleč ni bila zadovoljiva (60 %) za primarne tumorje in katerih odkrivanje lahko lahko vpliva na naravo lahke razgradnje RNA v normalnem okolju11.Genetski in epigenetski markerji se soočajo s problemom razširjenosti tumorjev in omejitvijo na vrste raka.

Metilacija DNA je močan kandidat za biomarker za zgodnje odkrivanje, odkar jo je Feinberg leta 198312 prvič povezal z rakom. Aberacije metilacije DNA opazimo v vseh stopnjah raka, že v predrakavi fazi.Aberantna hipermetilacija DNA običajno poteka na otokih CpG v promotorjih genov za preprečevanje tumorskih supresorjev 13,14.Študije so tudi pokazale, da je nenormalna hipermetilacija DNA vključena v uravnavanje razvojnih regulatorjev15.Dolina metilacije DNA, ki je običajno povezana z razvojnimi regulatorji in hipermetiliranimi vrstami raka, lahko preklopi način izražanja genov v bolj stabilen način, ki je odvisen od metilacije DNA, in zmanjša povezavo z metiliranim histonom H3K27me3 in povezanimi polikombnimi proteini 16,17.

Med velikim številom objavljenih označevalcev metilacije DNA jih je več uspešno debitiralo na trgu;vendar pa trenutni komercializirani označevalci metilacije DNK in diagnostični paneli še niso v celoti sprostili potenciala zgodnjega odkrivanja raka iz več razlogov18.Medtem ko ti biomarkerji večinoma kažejo sprejemljivo delovanje z uporabo informacij iz baze podatkov, ti biomarkerji običajno delujejo manj idealno v resničnem svetu zaradi dejstva, da so vzorci iz resničnega sveta pogosto bolj zapleteni in niso tako reprezentativni kot tisti, izbrani v zbirkah podatkov.Pokazalo se je, da ima zgodnje odkrivanje metilacije več rakov, ki temelji na sekvenciranju naslednje generacije, samo 16,8 % in 40,4 % občutljivost pri raku I. in II. stopnje19.Preizkusi zgodnjega odkrivanja zahtevajo večjo stabilnost in natančnejše biomarkerje.

Odkrivanje samo univerzalnega označevalca raka (UCOM) z uporabo zaporedja določanja položaja (GPS)

Kljub desetletjem raziskav o raku zadovoljivo preprečevanje in zdravljenje nista bili uresničeni.Potrebne so nove metodologije, ki bodo raziskovalcem omogočile temeljito ovrednotenje raka.V zadnjih 23 letih je bilo 6 znakov raka, kot so izogibanje apoptozi, invazija tkiv in metastaze itd., razširjenih na 14 z vključitvijo funkcij, kot so nemutacijsko epigenetsko reprogramiranje in polimorfni mikrobiomi 20, 21.Ko je razkritih več podrobnosti o raku, se v raziskave o raku odpira več perspektiv.Raziskovanje raka je postopoma prešlo v novo dobo v dveh smereh (skupnost in individualnost).Z razvojem natančne onkologije v zadnjih letih se raziskave raka osredotočajo na individualizirano ciljno terapijo in heterogenost raka22.Tako so se pred kratkim identificirani biomarkerji raka osredotočili predvsem na posebne vrste raka, kot sta rak materničnega vratu PAX623 in BMP3 za kolorektalni rak24.Učinkovitost teh biomarkerjev, specifičnih za vrste raka, se razlikuje, vendar še vedno ni mogoče, da bi dovzetni posamezniki opravili presejanje za vse vrste raka hkrati zaradi omejitve pridobivanja bioloških vzorcev in visokih stroškov.Idealno bi bilo, če bi lahko identificirali en sam robusten biomarker, ki bi bil učinkovit za vse vrste raka v začetni fazi.

Da bi dosegli tako idealen cilj, je treba s seznama možnih tipov biomarkerjev izbrati boljšega kandidata za biomarker.Znano je, da so aberacije metilacije DNA med vsemi genetskimi in epigenetskimi profili povezane z rakom in so nekatere od najzgodnejših, če ne prve, z rakom povezane nenormalnosti, ki se kronološko pojavijo.Preiskava metilacije DNA se je začela zgodaj, vendar jo je oviralo pomanjkanje raziskovalnih metod.Med 28 milijoni potencialnih metiliranih mest CpG v genomu je treba zaznati obvladljivo število in ga uskladiti z genomom, da bi bolje razumeli tumorigenezo.Celotno genomsko bisulfitno sekvenciranje (WGBS), ki velja za zlati standard sekvenciranja metilacije DNA, lahko pokrije le 50 % Cs v rakavih celicah zaradi narave zdravljenja z bisulfitom, ki razbije fragmente DNA in zmanjša kompleksnost genoma med transformacija Cs-v-Ts25.Druge metode, kot je 450k čipov, pokrivajo le 1,6 % metilacije genoma.Na podlagi 450.000 podatkov ima plošča za zaznavanje metilacije DNA 35,4 % občutljivost za 6 vrst raka I. stopnje26.Omejitve vrst raka, slabo delovanje in hrup, ki ga povzročajo metode odkrivanja v analitičnem procesu, so postale največje ovire za panele za odkrivanje raka.

Da bi bolje raziskali epigenetske vzorce celic med tumorigenezo in metastazami, smo razvili edinstven GPS za odkrivanje metilacije DNA v celotnem genomu, ki pokriva do 96 % mest CpG v 0,4 milijarde branj25.GPS je dvostranska metoda zaporedja, ki uporablja 3'-konec fragmenta DNA nekonvertibilnih metil-citozinov po obdelavi z bisulfitom, ki vodi poravnavo izračuna metilacije DNA 5'-konca prek sekvenciranja na koncu para (slika 1)25.Metil-citozinska vodilna veriga, ki deluje kot vzorčna veriga, pomaga pri poravnavi regije z visokim GC, ki obnovi najbolj opuščene podatke o zaporedju v tradicionalnem WGBS.Funkcija GPS z visoko pokritostjo zagotavlja ogromno informacij o metilaciji DNA, kar nam omogoča, da pregledamo profile metilacije raka z znatno višjo ločljivostjo v prej premalo raziskanih regijah.

GPS nam ponuja močno orodje za raziskovanje homogenosti raka, ki lahko močno poenostavi raziskave raka in potencialno najde univerzalno razlago za nastanek tumorjev in metastaze.Pri analizi GPS podatkov o rakavih celičnih linijah so pogosto naleteli na edinstven pojav.Bilo je več regij, za katere se je zdelo, da so nenormalno hipermetilirane v več vrstah vzorcev raka.Ta nepričakovana ugotovitev je bila nato potrjena, da služi kot UCOM.Analiziranih je bilo več kot 7000 vzorcev iz 17 vrst raka v zbirki podatkov The Cancer Genome Atlas (TCGA), med katerimi smo identificirali prvi UCOM, HIST1H4F, gen, povezan s histonom, ki je hipermetiliran pri vseh vrstah raka27.Serija UCOM je bila nato najdena in potrjena v zbirki podatkov TCGA, zbirki podatkov Gene Expression Omnibus (GEO) in kliničnih vzorcih iz resničnega sveta.Do zdaj so bili HIST1H4F, PCDHGB7 in SIX6 najdeni in potrjeni kot UCOM.Nepričakovano odkritje UCOM ponuja močan odgovor na potrebo po zgodnjem odkrivanju raka.UCOM ponujajo rešitev za odkrivanje več vrst raka z enim označevalcem.

Značilnosti UCOM

Po validaciji se je pokazalo, da imajo UCOM štiri glavne značilnosti, ki UCOM omogočajo, da presežejo učinkovitost trenutnih biomarkerjev (slika 2).

Edinstveno za malignost

UCOM so edinstveni za rakave ali predrakave spremembe in nanje ne vplivajo normalne fiziološke spremembe.Nekateri trenutni označevalci, povezani z rakom, ki so bili široko uporabljeni pri zgodnjem odkrivanju in/ali presejanju, so vodili do prevelike diagnoze.Povišane ravni PSA, klinično akreditirano presejalno orodje, se odkrijejo tudi pri benignih stanjih, kot sta hiperplazija prostate in prostatitis10.Prekomerna diagnoza in posledično prekomerno zdravljenje vodita do zmanjšane kakovosti življenja zaradi črevesnih, urinskih in spolnih zapletov28.Drugi biomarkerji, ki temeljijo na beljakovinah in se pogosto uporabljajo v kliničnem okolju, kot je CA-125, niso prinesli bistvenih koristi, medtem ko so povzročili prekomerno diagnosticiranje in prekomerno zdravljenje29.Visoka specifičnost UCOM za maligne bolezni se izogne tem pomanjkljivostim.UCOM, PCDHGB7, učinkovito razlikuje skvamozne intraepitelijske lezije visoke stopnje (HSIL) in rak materničnega vratu od normalnih vzorcev in skvamoznih intraepitelnih lezij nizke stopnje (LSIL), medtem ko lahko večina drugih biomarkerjev le razlikuje raka materničnega vratu od normalnih vzorcev30.Čeprav PCDHGB7 ne zazna pomembnih razlik med normalnim endometrijem in hiperplazijo endometrija, so zaznane pomembne razlike med normalnim endometrijem in atipično hiperplazijo, še večje razlike pa so zaznane med normalnim endometrijem in rakom endometrija (EC) na podlagi PCDHGB731.UCOM so edinstveni za maligne lezije v zbirkah podatkov in kliničnih vzorcih.Z vidika bolnika edinstveni UCOM znižajo prag za razumevanje zapletenih indikacij različnih slabo delujočih nestabilnih biomarkerjev in ustrezne tesnobe med postopkom ocenjevanja.Z vidika kliničnega zdravnika edinstveni UCOM ločijo maligne od benignih lezij, kar pomaga pri triaži bolnikov in zmanjša nepotrebne medicinske postopke in prekomerno zdravljenje.Zato edinstveni UCOM zmanjšujejo redundanco medicinskega sistema, lajšajo sistemske stiske in dajejo na voljo več zdravstvenih virov tistim, ki jih potrebujejo.

Slika 1 Shema poteka dela GPS za odkrivanje metilacije DNK25.Siva črta: vhodno zaporedje DNK;rdeča črta: DNA, obdelana s T4 DNA polimerazo, zamenjava citozina s 5'-metilcitozinom na 3' koncu vnosa;modra C z Me: metiliran citozin;modra C: nemetiliran citozin;rumena T: timin25.

Vse ali nič

UCOM so prisotni le v rakavih celicah in se stabilno odkrijejo v skoraj vseh rakavih celicah.Potrjeno je bilo, da je HIST1H4F hipermetiliran v skoraj vseh vrstah tumorjev, vendar ne v normalnih vzorcih27.Podobno se je tudi pokazalo, da sta PCDHGB7 in SIX6 hipermetilirana v vseh vzorcih tumorjev, vendar ne v normalnih vzorcih30-32.Ta edinstvena lastnost bistveno izboljša delovanje UCOM-jev glede meje zaznavanja in občutljivosti.Samo 2 % rakavih celic je mogoče razlikovati v vzorcih, zaradi česar je UCOM veliko bolj občutljiv biomarker kot večina obstoječih biomarkerjev30. Kot biomarker, ki se uporablja za odkrivanje kolorektalnega raka, obstajajo mutacije KRAS samo v približno 36 % primerov kolorektalnega raka, kar kaže na slab diagnostični potencial33.Nizka razširjenost mutacij KRAS pri kolorektalnem raku omejuje KRAS v kombinaciji z drugimi biomarkerji.Dejansko se lahko kombinacija biomarkerjev na začetku zdi obetavna, vendar ne ustvari vedno zadovoljivih rezultatov, hkrati pa pokaže veliko večji šum pri analizi zaznavanja in običajno vključuje bolj zapletene eksperimentalne postopke.Nasprotno pa PCDHGB7 in drugi UCOM obstajajo pri vseh oblikah raka.UCOM zaznava rakave komponente v različnih vrstah vzorcev raka z največjo natančnostjo, medtem ko izkorenini zapletene postopke analize hrupa.V obilnem vzorcu raka ni težko odkriti, v majhnem vzorcu pa je izjemno zahtevno.UCOM lahko odkrijejo majhne količine raka.

Slika 2 Značilnosti UCOM-jev.

Odkrivanje raka pred patološkimi spremembami

UCOM je mogoče odkriti v predrakavi fazi pred patološkimi spremembami.Kot epigenetski biomarkerji se nenormalnosti UCOM pojavijo v zgodnejši fazi kot fenotipske nenormalnosti in jih je mogoče zaznati med tumorigenezo, napredovanjem in metastazami34,35.Občutljivost UCOM sčasoma poveča učinkovitost UCOM pri odkrivanju zgodnjega stadija raka in predrakavih lezij.Odkrivanje zgodnjega raka na podlagi biopsij in citologije je lahko težavno tudi za najbolj izkušene patologe.Enkratna biopsija, pridobljena s kolposkopijo, je bila pozitivna pri 60,6 % vzorcev HSIL+.Za več lezij so potrebne dodatne biopsije za povečanje občutljivosti36.Nasprotno pa ima UCOM, PCDHGB7, občutljivost 82 % za vzorce HSIL+, kar presega občutljivost biopsij in večine biomarkerjev30.Označevalec metilacije, FAM19A4, ima občutljivost 69 % za CIN2+, kar je podobno citologiji, vendar ne more razlikovati CIN1 od običajnih vzorcev37.Izkazalo se je, da so UCOM veliko bolj občutljiv biomarker za zgodnje odkrivanje.V primerjavi s patologi, ki temeljijo na izkušnjah, imajo UCOM boljšo občutljivost za odkrivanje zgodnjih stadijev raka, kar posledično prispeva k izboljšani prognozi raka in preživetju30.Poleg tega UCOM ponujajo platformo za odkrivanje, ki je dostopna območjem, kjer primanjkuje izkušenih patologov, in močno izboljša učinkovitost odkrivanja.Z enotnimi postopki vzorčenja in odkrivanja zagotavlja odkrivanje UCOM stabilne rezultate, ki jih je enostavno razlagati in bolje ustrezajo presejalnemu protokolu, ki zahteva manj strokovnega osebja in zdravstvenih virov.

Enostavno zaznati

Trenutne metode za odkrivanje metilacije DNA so zapletene in dolgotrajne.Večina metod zahteva bisulfitno transformacijo, kar povzroči izgubo kakovosti vzorca in lahko povzroči nestabilne in netočne rezultate.Slaba ponovljivost, ki jo povzroča zdravljenje z bisulfitom, lahko povzroči zmedo pri zdravnikih in bolnikih ter dodatno moti nadaljnje spremljanje in/ali strategije zdravljenja.Zato smo dodatno spremenili metodo odkrivanja UCOM, da bi se izognili problematični obdelavi vzorcev z bisulfitom, prilagodili zahtevam klinične uporabe in izboljšali dostopnost.Razvili smo novo metodo z uporabo restrikcijskih encimov, občutljivih na metilacijo, v kombinaciji s fluorescenčno kvantitativno PCR v realnem času (Me-qPCR) za kvantificiranje statusa metilacije UCOM v 3 urah z uporabo preprostih postopkov rokovanja (slika 3).Me-qPCR lahko sprejme več vrst vzorcev, kot je klinično zbiranje telesnih tekočin in samoodvzeti vzorci urina.Zbrane klinične vzorce je mogoče obdelati, shraniti in enostavno nadaljevati z odkrivanjem z uporabo standardizirane in avtomatizirane ekstrakcije DNK.Ekstrahirano DNK lahko nato neposredno nanesete na platformo Me-qPCR za reakcijo v eni posodi in rezultate kvantifikacije izhoda.Po preprosti analizi rezultatov z uporabo diagnostičnih modelov, prilagojenih in potrjenih za specifične vrste raka, se končna določitev rezultatov odkrivanja UCOM interpretira in predstavi kot polkvantitativna vrednost.Platforma Me-qPCR prekaša tradicionalno bisulfitno pirosekvenciranje pri odkrivanju UCOM, hkrati pa prihrani 3 ure pretvorbe bisulfita v skladu s protokolom kompleta EZ DNA Methylation-Gold.Inovativna platforma za zaznavanje metilacije naredi zaznavanje UCOM stabilnejše, natančnejše in bolj dostopno30.

Slika 3 Postopek odkrivanja UCOM-jev.Vrste vzorcev vključujejo profesionalno vzorčeno BALF, ščetko Pap in/ali lastno zbran urin.Postopek ekstrakcije DNK je mogoče prilagoditi avtomatskemu ekstraktorju, katerega produkt je mogoče neposredno zaznati s qPCR.

Uporaba UCOM-jev

Pljučni rak

Pljučni rak je drugi najpogosteje diagnosticiran in najbolj smrtonosen rak na svetu, saj predstavlja 11,4 % novih primerov in 18,0 % novih smrti1.Med vsemi diagnozami je 85 % nedrobnoceličnega pljučnega raka (NSCLC) in 15 % drobnoceličnega pljučnega raka (SCLC), ki ima višjo stopnjo malignosti38.Pregledovanje z nizkoodmerno računalniško tomografijo (LDCT) je trenutno priporočena presejalna metoda za pljučni rak in dokazano izboljšuje zgodnje odkrivanje in zmanjšuje umrljivost6;vendar pa zaradi nizke specifičnosti in slabe dostopnosti LDCT še ni služil kot zadovoljiva presejalna metoda, tako kot drugi običajni označevalci raka, kot je CEA39.Stroški in možnosti za zgrešene diagnoze in napačne diagnoze presejalne strategije LDCT ovirajo napredek promocije presejanja za pljučnega raka40.HIST1H4F, UCOM, ima ogromen potencial kot biomarker za zgodnje odkrivanje v vzorcih bronhoalveolarne tekočine (BALF)27.HIST1H4F je hipermetiliran pri pljučnem adenokarcinomu in ploščatoceličnem karcinomu pljuč s specifičnostjo odkrivanja 96,7 % in občutljivostjo 87,0 % (slika 4A) ter izjemno učinkovitostjo pri raku I. stopnje27.HIST1H4F ima specifičnost 96,5 % in občutljivost 85,4 % za NSCLC ter 96,5 % oziroma 95,7 % za SCLC27.Poleg tega so vzorci osmih drugih vrst raka, vključno z rakom trebušne slinavke in debelega črevesa in danke, potrdili, da je HIST1H4F hipermetiliran pri vseh osmih vrstah27.

Rak materničnega vratu

Rak materničnega vratu je bil leta 2020 četrti najpogosteje diagnosticiran rak in četrti vodilni vzrok smrti zaradi raka pri ženskah, kar je predstavljalo 3,1 % novih primerov in 3,4 % smrti, povezanih z rakom, na svetovni ravni1.Za odpravo raka materničnega vratu do leta 2030, kot predlaga WHO, je zgodnje odkrivanje raka materničnega vratu nujno.Če je odkrit v zgodnji fazi, doseže 5-letno preživetje 92 % pri invazivnem raku materničnega vratu41.Smernice Ameriškega združenja za boj proti raku (ACS) predlagajo cervikalne citološke teste, primarne teste HPV ali skupne teste za presejanje42.Cervikalna citologija je invazivna in lahko odkrije le 63,5 % primerov CIN2+37.

V nasprotju s tem se je PCDHGB7 veliko bolje obnesel z uporabo Pap brisov in vaginalnih izločkov ter lahko učinkovito razlikuje HSIL od LSIL v zelo zgodnji fazi.Sam PCDHGB7 ima občutljivost 100,0 % in specifičnost 88,7 % za raka materničnega vratu (slika 4B) ter 82,1 % občutljivost in 88,7 % specifičnost za vzorce HSIL+30.PCDHGB7 ima tudi 90,9-odstotno občutljivost in 90,4-odstotno specifičnost vzorcev vaginalnega izločka za raka materničnega vratu, ki jih je veliko lažje zbrati30.V kombinaciji s testom HPV z visokim tveganjem (hr) ali citološkim testom Thinprep (TCT) ima PCDHGB7 povečano občutljivost za 95,7 % in specifičnost za 96,2 %, kar znatno presega test hrHPV (20,3 %), TCT (51,2 %). ), in oba skupaj (57,8 %) za raka materničnega vratu30.Izkazalo se je tudi, da je PCDHGB7 hipermetiliran pri 17 vrstah raka iz baze podatkov TCGA, kar kaže na njegovo primernost v družini UCOM30.

Slika 4 UCOM so bili potrjeni pri štirih vrstah raka v obsežnih kliničnih študijah.A. Učinkovitost HIST1H4F, UCOM, pri odkrivanju pljučnega raka 508 vzorcev.B. Učinkovitost PCDHGB7, UCOM, pri odkrivanju raka materničnega vratu 844 vzorcev.C. Učinkovitost PCDHGB7, UCOM, pri odkrivanju raka endometrija 577 vzorcev Papa in Tao ščetke endometrija.D. Učinkovitost SIX6, UCOM, pri odkrivanju urotelijskega raka 177 vzorcev.

EC je eden najpogostejših rakov ženskega reproduktivnega sistema po vsem svetu, z ocenjenimi 4,2 milijona novih primerov in 1 % z rakom povezanih smrti letno1.Z uspešno diagnozo v zgodnji fazi je EC ozdravljiv in ima 95-odstotno 5-letno stopnjo preživetja pri raku I. stopnje.Bolnice, ki imajo simptome, kot je nenormalna krvavitev iz maternice, so deležne rednih kliničnih pregledov in invazivnih in bolečih biopsijskih postopkov, kljub temu, da se le pri 5 %–10 % sčasoma razvije EC43.Transvaginalni ultrazvok kot običajna metoda odkrivanja je zelo nezanesljiv zaradi nezmožnosti razlikovanja benignih od malignih sprememb endometrija in visoke stopnje lažno pozitivnih44.

Izvedena je bila vzporedna primerjava seruma CA-125, široko uveljavljenega biomarkerja EC, in PCDHGB7.Serumski CA-125 je imel občutljivost 24,8 %, kar nakazuje, da je CA-125 neustrezen marker za EC kljub specifičnosti 92,3 %31.Odkrivanje PCDHGB7 z uporabo vzorcev ščetke Pap je dalo občutljivost 80,65 % in specifičnost 82,81 % za stopnje ECatall, medtem ko je imela ščetka Tao občutljivost 61,29 % in specifičnost 95,31 %31.Diagnostični model PCDHGB7, ki temelji na Me-qPCR, je prinesel občutljivost 98,61 %, specifičnost 60,5 % in skupno natančnost 85,5 % z uporabo vzorcev s čopičem Pap in Tao (slika 4C)31.

Urotelijski rak

Urotelijski rak, ki ga sestavljajo rak mehurja, ledvičnega pelvisa in sečnice, je bil sedmi najpogosteje diagnosticiran rak leta 2020 po vsem svetu in je povzročil 5,2 % novih primerov in 3,9 % smrti1.Urotelijski rak, od katerih je več kot 50 % rak mehurja, je bil leta 2022 četrti najpogosteje diagnosticiran rak v Združenih državah, kar je predstavljalo 11,6 % na novo diagnosticiranih primerov3.Približno 75 % rakov mehurja je razvrščenih kot nemišično invazivni rak mehurja, omejen na sluznico ali submukozo45.Cistoskopska biopsija je zlati standard za diagnosticiranje urotelijskega raka, ki se izvaja s fluorescenčno in situ hibridizacijo (FISH) in citološkimi testi.FISH in citologija imata slabo diagnostično učinkovitost, cistoskopija pa je vsiljiva in ima osnovno tveganje za izostanek mikrolezij, napačno razlago lezij in potencialno povzroči širjenje ali ponovitev raka46.Prej potrjeni UCOM, PCDHGB7, se je prav tako izkazal za hipermetiliranega pri urotelijskem raku, s površino pod krivuljo 0,86, kar kaže na potencialno diagnostično sposobnost30.Za nadaljnjo validacijo več UCOM in boljšo prilagoditev več vrstam vzorcev je bil pregledan SIX6, nov UCOM, ki je pokazal odličen diagnostični potencial pri zgodnjem odkrivanju urotelijskega raka z uporabo vzorcev urina na platformi Me-qPCR.Odkrivanje SIX6 z uporabo vzorcev urina je pokazalo konkurenčno občutljivost 86,7 % in specifičnost 90,8 % (slika 4D), hkrati pa je bilo neinvazivno in ga je enostavno pridobiti32.Potencial SIX6 pri spremljanju metastaz in vrednotenju učinkovitosti zdravljenja je trenutno v preiskavi.

Prihodnost in izzivi

UCOM-ji so zelo učinkoviti pri diagnostičnem potencialu več vrst raka, vendar je treba opraviti še veliko dela.Širili smo seznam UCOM in aktivno potrjevali UCOM pri več vrstah raka, vključno s tistimi, ki jih je tradicionalno težko odkriti.Rezultati validacije iz baz podatkov TCGA so dodatno potrdili uporabo UCOM pri več vrstah raka in več situacijah.V predhodni preiskavi se je izkazalo, da imajo UCOM močan diagnostični potencial za holangiokarcinome in adenokarcinome trebušne slinavke, ki jih je skoraj nemogoče diagnosticirati v zgodnji fazi s trenutnimi metodami presejanja32,47.Sposobnost odkrivanja redkih vrst raka z UCOM je mogoče uporabiti s krožečo tumorsko DNK (ctDNA) z izboljšano platformo za tekočo biopsijo48.Študija, ki je vključevala ploščo za odkrivanje pan-raka na osnovi plazemske DNK, je dala občutljivost 57,9 %49.Kljub visoki specifičnosti splošna uspešnost razkriva, da je še vedno prostor za izboljšave.

Edinstvene značilnosti UCOM so podprle tudi raziskavo potenciala UCOM pri vrednotenju učinkovitosti zdravljenja in spremljanju ponovitev.V skladu z merili za oceno odziva pri solidnih tumorjih (RECIST) je medicinsko slikanje priporočena metodologija za spremljanje ponovitve in oceno učinkovitosti zdravljenja, medtem ko se za oceno uporabljajo samo tumorski markerji50.V resnici pa na pristope slikanja močno vplivata pogostost in čas, zato so bolniki izpostavljeni večjemu tveganju in stroškom51,52.Za SIX6 je bilo potrjeno, da služi kot napovedovalec metastaz raka dojke32.Spremljanje ctDNA na podlagi tekoče biopsije omogoča nadzor nad minimalnimi preostalimi boleznimi v realnem času nekaj mesecev pred radiološkim odkrivanjem, kar idealno odloži in prepreči napredovanje raka, povezano s ponovitvijo bolezni53.Predhodni rezultati kažejo, da UCOM odražajo raven rakave hipermetilacije v realnem času takoj po operaciji in zdravljenju32.Visoka občutljivost, ki jo kažejo UCOM, in uporabnost v več vrstah neintruzivnih vzorcev omogoča, da UCOM služijo kot natančen biomarker za spremljanje ponovitve, hkrati pa ohranjajo visoko pripravljenost pacientov.

Hkrati je javna dostopnost testa drugo pomembno vprašanje, ki zahteva dodatne napore.Medtem ko je bilo sodelovanje UCOM pri odkrivanju sprejeto v več bolnišnicah v upanju, da bo koristilo več pacientom, so se pro bono odkrivanja in pregledi aktivno izvajali na podeželju Kitajske.UCOM-ji potrebujejo izboljšano dostopnost, da bi bili izvedljivo orodje za pregledovanje, zlasti za nerazvita območja.

Čeprav so rezultati aplikacije UCOM pri zgodnjem odkrivanju obetavni, obstaja veliko neznank o UCOM.Z aktivnim raziskovanjem so potrebne dodatne raziskave o tem, zakaj so UCOM univerzalno prisotni pri raku.Osnovni mehanizmi epigenetske regulacije, na katerih temelji UCOM, so vredni nadaljnje preiskave, kar bi lahko upravičilo novo usmeritev za terapevtiko raka.Če se vrnemo k medsebojnemu delovanju med homogenostjo in heterogenostjo tumorja, nas zanima, zakaj so lahko UCOM izjema od večine biomarkerjev raka, ki so tesno povezani s specifičnimi vrstami raka.Vloga aberacij metilacije DNK, ki jih je identificiral UCOM, pri tumorigenezi, napredovanju tumorja in metastazah ni bila določena v procesu izgube in ponovne pridobitve celične identitete in zahteva temeljit pregled.Drugo veliko zanimanje je v obsegu vključitve lastnosti homogenosti UCOM s tkivno edinstvenimi markerji v upanju, da se približamo natančnemu odkrivanju sledi raka in identifikaciji izvora tumorskega tkiva na obratni način.UCOM je lahko idealno orodje za preprečevanje raka, odkrivanje raka ter potencialno obrambo in odpravo raka.

Podpora za nepovratna sredstva

To delo so podprli Kitajski nacionalni ključni raziskovalni in razvojni program (št. donacije 2022BEG01003), nacionalna naravoslovna fundacija Kitajske (št. donacij 32270645 in 32000505), donacija zdravstvene komisije province Heilongjiang (št. donacije 2020-111) , in štipendija Inštituta za znanost in tehnologijo Heze (št. štipendije 2021KJPT07).

Izjava o navzkrižju interesov

Wei Li je direktor raziskav in razvoja za Shanghai Epiprobe Biotechnology Co., Ltd. Wenqiang Yu je član znanstvenega svetovalnega odbora Epiprobe.W. Yu in Epiprobe sta odobrila patente v teku, povezane s tem delom.Vsi drugi avtorji izjavljajo, da nimajo konkurenčnih interesov.

Avtorski prispevki

Zasnovala in oblikovala projekt: Chengchen Qian in Wenqiang Yu.

Prispevek je napisal: Chengchen Qian.

Naredil ilustracije: Chengchen Qian.

Pregledali in uredili rokopis: Xiaolong Zou, Wei Li, Yinshan Li in Wenqiang Yu.

Reference

1. Sung H, Ferlay J, Siegel RL, LaversanneM, Soerjomataram I, Jemal A, et al.Globalna statistika raka 2020: ocene GLOBOCAN za

incidenca in umrljivost po vsem svetu za 36 vrst raka v 185 državah.CA Cancer J Clin.2021;71: 209-49.

2. Xia C, Dong X, Li H, Cao M, Sun D, He S, et al.Statistika raka na Kitajskem in v Združenih državah, 2022: profili, trendi in determinante.Chin MedJ (angl.).2022;135: 584-90.

3. Siegel RL, Miller KD, WagleNS, JemalA.Statistika raka, 2023. CA Cancer J Clin.2023;73: 17-48.

4. Crosby D, BhatiaS, Brindle KM, Coussens LM, Dive C, Emberton M, et al.Zgodnje odkrivanje raka.Znanost.2022;375: eaay9040.

5. Ladabaum U, Dominitz JA, KahiC, Schoen RE.Strategije za

presejalni pregled kolorektalnega raka.Gastroenterologija.2020;158: 418-32.

6. Tanoue LT, Tanner NT, Gould MK, Silvestri GA.Presejanje pljučnega raka.Am J Respir Crit Care Med.2015;191: 19-33.

7. Bouvard V, WentzensenN, Mackie A, Berkhof J, BrothertonJ, Giorgi-Rossi P, et al.Pogled IARC na presejanje raka materničnega vratu.N EnglJ Med.2021;385: 1908-18.

8. Xue P, Ng MTA, QiaoY.Izzivi kolposkopije za odkrivanje raka materničnega vratu v LMIC in rešitve umetne inteligence.BMC Med.2020;18: 169.

9. Johnson P, Zhou Q, Dao DY, Lo YMD.Cirkulacijski biomarkerji pri diagnozi in zdravljenju hepatocelularnega karcinoma.Nat Rev Gastroenterol Hepatol.2022;19: 670-81.

10. Van PoppelH, Albreht T, Basu P, HogenhoutR, CollenS, Roobol M. Zgodnje odkrivanje raka prostate na osnovi serumskega PSA v Evropi in po svetu: preteklost, sedanjost in prihodnost.Nat Rev Urol.2022;19:

562-72.

11. HolyoakeA, O'Sullivan P, Pollock R, Best T, Watanabe J, KajitaY,

et al.Razvoj multipleksnega RNA urinskega testa za odkrivanje in stratifikacijo prehodnoceličnega karcinoma mehurja.Clin Cancer Res.2008;14: 742-9.

12. Feinberg AP, Vogelstein B. Hipometilacija razlikuje gene nekaterih človeških rakov od njihovih običajnih dvojnikov.Narava.1983;301: 89-92.

13. Ng JM, Yu J. Spodbujevalnik hipermetilacije tumorskih supresorskih genov kot potencialnih biomarkerjev pri kolorektalnem raku.IntJ Mol Sci.2015;16: 2472-96.

14. Esteller M. Epigenomika raka: metilomi DNA in zemljevidi modifikacije histona.Nat Rev Genet.2007;8: 286-98.

15. Nishiyama A, Nakanishi M. Krmarjenje po krajini metilacije DNA raka.Trendi Genet.2021;37: 1012-27.

16. Xie W, Schultz MD, ListerR, Hou Z, Rajagopal N, Ray P, et al.Epigenomska analiza večlinijske diferenciacije človeških embrionalnih izvornih celic.Celica.2013;153: 1134-48.

17. Li Y, Zheng H, Wang Q, Zhou C, WeiL, Liu X, et al.Analize celotnega genoma razkrivajo vlogo zdravila Polycomb pri spodbujanju hipometilacije metilacijskih dolin DNA.Genome Biol.2018;19:18.

18. Koch A, JoostenSC, Feng Z, de Ruijter TC, DrahtMX, MelotteV,

et al.Analiza metilacije DNA pri raku: ponovno obiskana lokacija.Nat Rev Clin Oncol.2018;15: 459-66.

19. KleinEA, Richards D, Cohn A, TummalaM, Lapham R, Cosgrove D, et al.Klinična validacija ciljanega testa zgodnjega odkrivanja več rakavih obolenj, ki temelji na metilaciji, z uporabo neodvisnega validacijskega niza.Ann Oncol.2021;32: 1167-77.

20. Hanahan D, Weinberg RA.Znaki raka.Celica.2000;100: 57-70.

21. Hanahan D. Znaki raka: nove razsežnosti.Rak Discov.2022;12: 31-46.

22. Schwartzberg L, Kim ES, Liu D, Schrag D. Precizna onkologija: kdo, kako, kaj, kdaj in kdaj ne?Am Soc Clin Oncol Educ Book.2017: 160-9.

23. Liu H, Meng X, Wang J. Kvantitativna metilacija v realnem času

odkrivanje gena PAX1 pri presejanju raka materničnega vratu.IntJ Gynecol Cancer.2020;30: 1488-92.

24. Imperiale TF, RansohoffDF, Itzkowitz SH, Levin TR, Lavin P, Lidgard GP, et al.Multitargetstool DNK testiranje za presejanje kolorektalnega raka.N EnglJ Med.2014;370: 1287-97.

25. Li J, Li Y, Li W, Luo H, Xi Y, Dong S, et al.Pozicioniranje vodnika

sekvenciranje identificira nenormalne vzorce metilacije DNA, ki spreminjajo celično identiteto in omrežja tumorskega imunskega nadzora.Genom

Res.2019;29: 270-80.

26. Gao Q, LinYP, Li BS, Wang GQ, Dong LQ, Shen BY, et al.Nevsiljivo odkrivanje več rakavih obolenj s krožečim brezceličnim zaporedjem metilacije DNA (THUNDER): razvojne in neodvisne validacijske študije.Ann Oncol.2023;34: 486-95.

27. Dong S, Li W, Wang L, Hu J, Song Y, Zhang B, et al.Geni, povezani s histonom, so pri pljučnem raku hipermetilirani in hipermetilirani

HIST1H4F bi lahko služil kot biomarker pan-raka.Cancer Res.2019;79: 6101-12.

28. HeijnsdijkEA, Wever EM, AuvinenA, Hugosson J, Ciatto S, Nelen V, et al.Učinki presejanja za prostato specifičnega antigena na kakovost življenja.N EnglJ Med.2012;367: 595-605.

29. LuzakA, Schnell-Inderst P, Bühn S, Mayer-Zitarosa A, Siebert U. Klinična učinkovitost presejalnih testov biomarkerjev za raka, ki se ponujajo kot samoplačniške zdravstvene storitve: sistematični pregled.Eur J Javno zdravje.2016;26: 498-505.

30. Dong S, Lu Q, Xu P, Chen L, Duan X, Mao Z, et al.

Hipermetiliran PCDHGB7 kot univerzalni marker samo za raka in njegova uporaba pri zgodnjem presejanju raka materničnega vratu.Clin Transl Med.2021;11: e457.

31. Yuan J, Mao Z, Lu Q, Xu P, Wang C, Xu X, et al.Hipermetilirani PCDHGB7 kot biomarker za zgodnje odkrivanje raka endometrija v vzorcih ščetk endometrija in ostružkih materničnega vratu.Sprednji Mol Biosci.2022;8: 774215.

32. Dong S, Yang Z, Xu P, Zheng W, Zhang B, Fu F, et al.Vzajemno

ekskluzivna epigenetska modifikacija na SIX6 s hipermetilacijo za predrakavo stopnjo in sledenje pojavu metastaz.Transduct Target Ther.2022;7: 208.

33. Huang L, Guo Z, Wang F, Fu L. Mutacija KRAS: od nezdravljivih do zdravilnih pri raku.Signal Transduct Target Ther.2021;6: 386.

34. Belinsky SA, Nikula KJ, PalmisanoWA, MichelsR, SaccomannoG, GabrielsonE, et al.Aberantna metilacija p16 (INK4a) je prvi dogodek pri pljučnem raku in potencialni biomarker za zgodnjo diagnozo.Proc Natl Acad Sci U SA.1998;95: 11891-6.

35. Robertson KD.Metilacija DNK in človeška bolezen.Nat Rev Genet.2005;6: 597-610.

36. WentzensenN, Walker JL, Gold MA, Smith KM, ZunaRE,

Mathews C, et al.Večkratne biopsije in odkrivanje prekurzorjev raka materničnega vratu pri kolposkopiji.J Clin Oncol.2015;33: 83-9.

37. De Strooper LM, Meijer CJ, Berkhof J, Hesselink AT, Snijders

PJ, Steenbergen RD, et al.Analiza metilacije FAM19A4

gen v odrgninah materničnega vratu je zelo učinkovit pri odkrivanju materničnega vratu

karcinomi in napredovale lezije CIN2/3.Rak Prev Res (Phila).2014;7: 1251-7.

38. Thai AA, Solomon BJ, Sequist LV, Gainor JF, Heist RS.Pljučni rak.Lanceta.2021;398: 535-54.

39. Grunnet M, Sorensen JB.Karcinoembrionalni antigen (CEA) kot tumorski marker pri pljučnem raku.Pljučni rak.2012;76: 138-43.

40. Wood DE, KazerooniEA, Baum SL, EapenGA, EttingerDS, Hou L, et al.Presejanje pljučnega raka, različica 3.2018, Smernice klinične prakse NCCN v onkologiji.J Natl Compr Canc Netw.2018;16: 412-41.

41. Ameriško združenje za raka.Dejstva in številke o raku.Atlanta, GA, ZDA: American Cancer Society;2023 [posodobljeno 1. marca 2023;citirano 2023 22. avgusta].

42. FonthamETH, Wolf AMD, Church TR, EtzioniR, Flowers CR,

Herzig A, et al.Presejanje raka materničnega vratu za posameznike s povprečnim tveganjem: posodobitev smernic za leto 2020 Ameriškega združenja za boj proti raku.CA Cancer J Clin.2020;70: 321-46.

43. Clarke MA, Long BJ, Del Mar MorilloA, Arbyn M, Bakkum-Gamez JN, Wentzensen N. Povezava tveganja raka endometrija s krvavitvijo po menopavzi pri ženskah: sistematični pregled in metaanaliza.JAMA Intern Med.2018;178: 1210-22.

44. Jacobs I, Gentry-MaharajA, Burnell M, ManchandaR, Singh N,

Sharma A, et al.Občutljivost transvaginalnega ultrazvočnega pregleda

za raka endometrija pri ženskah po menopavzi: študija primera in kontrole v kohorti UKCTOCS.Lancet Oncol.2011;12: 38-48.

45. BabjukM, Burger M, CompératEM, Gontero P, MostafidAH,

PalouJ, et al.Smernice Evropskega urološkega združenja o nemišičnoinvazivnem raku mehurja (TaT1 in karcinom in situ) -

Posodobitev 2019.Eur Urol.2019;76: 639-57.

46. Aragon-Ching JB.Izzivi in napredek v diagnostiki, biologiji in zdravljenju urotelijskega karcinoma zgornjega trakta in mehurja.Urol Oncol.2017;35: 462-4.

47. Rizvi S, KhanSA, Hallemeier CL, Kelley RK, Gores GJ.

Holangiokarcinom – razvijajoči se koncepti in terapevtske strategije.Nat Rev Clin Oncol.2018;15: 95-111.

48. Ye Q, Ling S, Zheng S, Xu X. Tekoča biopsija v hepatocelularnem

karcinom: krožeče tumorske celice in krožeča tumorska DNA.Mol Rak.2019;18: 114.

49. Zhang Y, Yao Y, Xu Y, Li L, Gong Y, Zhang K, et al.Pan-rak

odkrivanje DNK krožečega tumorja pri več kot 10.000 kitajskih bolnikih.Nat Commun.2021;12:11.

50. Eisenhauer EA, Therasse P, BogaertsJ, Schwartz LH, Sargent D, Ford R, et al.Nova merila za oceno odziva pri solidnih tumorjih: revidirana smernica RECIST (različica 1.1).Eur J Rak.2009;45: 228-47.

51. LitièreS, Collette S, de Vries EG, Seymour L, BogaertsJ.RECIST - učenje iz preteklosti za gradnjo prihodnosti.Nat Rev Clin Oncol.

2017;14: 187-92.

52. Seymour L, BogaertsJ, Perrone A, FordR, Schwartz LH, Mandrekar S, et al.iRECIST: smernice za merila odziva za uporabo v preskušanjih

testiranje imunoterapevtikov.Lancet Oncol.2017;18: e143-52.

53. PantelK, Alix-Panabières C. Tekoča biopsija in minimalna rezidualna bolezen – najnovejši napredek in posledice za zdravljenje.Nat Rev Clin Oncol.2019;16: 409-24.

Citirajte ta članek kot: Qian C, Zou X, Li W, Li Y, Yu W. Predstraža proti raku: univerzalni označevalci raka.Cancer Biol Med.2023;20: 806-815.

doi: 10.20892/j.issn.2095-3941.2023.0313

Čas objave: maj-07-2024

Predstraža proti raku: univerzalni označevalci raka